Malaria Plasmodium DNA/RNA LAMP
Papirversion forefindes (sted):Orange mappe i Kopirummet (rum nr. 380.37.403). Bilag 1-5 findes ved Alethia Lamp testenheden (rum nr. 480.43.401). |
| Formål At sikre korrekt beskrivelse af arbejdsgang for bioanalytikere og læger. At påvise malariaparasitter i blod ved DNA-amplifikation (LAMP test).
Udføres ved feber eller anden klinisk mistanke om malaria hos en patient som
har rejst i områder med forekomst af malaria. Undersøgelsen er ikke en behandlingskontrol. Ved malaria påvisning ved LAMP at beskrive fremstilling af præparater til mikroskopi for malaria og Plasmodium malaria antigen. |
| Definitioner LAMP: Loop-medieret amplifikation |
| Prøvemateriale Veneblod. EDTA 3 ml veneblod. Blod anbefales testet straks, men kan opbevares i op til 7 dage ved rumtemperatur eller i køleskab (2-8° C) i op til 14 dage før testning. Efter endt analysering (LAMP negative og LAMP positive efter Giemsa-farvning og antigen er sat i gang) fryses hele blodprøven i wwLab's fryseprogram FR. I wwLab tastes FR og der sættes et flueben i boksen "hele prøven". Print en fryselabel og sæt label så stregkoden delvist dækkes, men ikke EDI eller Labka-nummer. Derved gemmes hele prøven i wwLab. Prøven fryses ved -80° C i Gorm's projektfryser (rum 380.40.404) i rød frysekasse (Depot 3). Ved ny kasse, husk at skrive det nye frysekassenummer på kassen. Der henvises til malaria LAMP hjælpeskema PA1. Malaria LAMP hjælpeskema PA1 forefindes fysisk i Modtagelsens Faneblade. |
Apparatur
|
| Arbejdsgang ved analysering Denne fremgangsmåde følges ved LAMP testen: Ved modtagelse af EDTA-blod til malaria Plasmodium DNA/RNA analyse startes altid med at tage blodprøven fra prøvemodtagelse til SARS-LAB (rum 480.43.401). Ved synlig kontaminering af EDTA-blodprøven aftørres den med klor-klud og 70% ethanol inden den tages i arbejde. Alethia apparatet findes i SARS-LAB (midlertidig løsning). Procedure med håndtering af blod foretages på bordet. Anvend altid nitril engangshandsker. KlargøringTænd Alethia-apparatet bagpå. Det skal varme op til 63° C inden det kan anvendes. Placer Wasserman-papir, der hvor man vil arbejde (opfanger evt. dråber fra blodprøver) Anvend Malaria Alethia workstation (prøverør-stativ). Alethia kit og Alethia workstation står i skab ved Alethia-apparatet. Placer Alethia workstation, gul skraldespand med pose til risikoaffald og pipettespidser med filter på wasserman-papir. Find stopur frem. Klargør prøverør og kit-rør med reagenser og markér rør. EDTA-blodprøverør, Buffer 1 rør (rødt låg), SMP PREP IV rør (rødt låg), Tube 1 rør (klart låg) og testenheden (består af et venstre test kammer og højre kontrol kammer) stilles alle klar i workstation stativet. Find blå propper til blodprøverør-frysning frem. Vagtprøver stilles i prøvemodtagelsens køleskab (modtagekøleskab 4) i stativ under dato og fryses af bioanalytiker dagen efter. Analyse Husk at skifte pipettespidser med filterspids ved hvert step! Ved evt. synlig forurening af pipette eller workstation under proceduren aftørres de med klor-klud og 70% ethanol inden man fortsætter arbejdet.  Når programmet er aktiveret skannes stregkoden på blodprøven på Alethia-instrumentet (til højre). Max. 10 prøver kan køres af gangen. Blok A og Blok B kan køre 5 ad gangen og Blok B kan sættes i gang selv om der er sat prøver over i Blok A. Analysen tager 40 minutter. Husk at slukke for Alethia-instrumentet når LAMP svar er aflæst. Rengøring Rengøring efter hver kørsel! Wasserman-papir skiftes efter kørsel. Anvend nitril engangshandsker, da der arbejdes med klor. Alethia pipette, workstation, og bord tørres med frisk klor-klud og tørres efter med ren 70% ethanol soft-klud efter start af malaria programmet. Efterbehandling Positiv malaria LAMP konfirmeres ved mikroskopi og malaria antigenpåvisning (indtil vi ikke har mere malaria antigen kit). Positiv malaria LAMP svares foreløbigt ud, fortolkes og fryses først efter fremstilling af Giemsa farvning til mikroskopi og antigen er sat over. Den positive malaria LAMP blodprøve tages ALTID ned i farvebænken hvor mikroskopi og antigen forberedes. Hvis malaria LAMP er påvist, fremstilles 2 ufikserede dråbepræparater og 2 methanol fikserede udstrygningspræparater fra venøs EDTA blod. Præparaterne Giemsa-farves i 30 minutter (se instruks Giemsa-farvning). Præparaterne fremstilles enten som beskrevet i malaria mikroskopi databladet eller ved brug af HEMAPREP, hvor der anvendes kapillærrør (se nedenfor). Efter brug renses instrumentets spredningsblade for blodrester ved brug af linsepapir og sterilt vand. Derefter anvendes en spritswab.  Sterilt kapillær rør For at fremskynde processen, kan mikroskopipræparaterne fremstilles i vagten, samtidig med at LAMP-testen analyseres, men LAMP udføres altid først, efter aftale med vagthavende KMA læge. Vagthavende læge overtager igangsatte malaria LAMP og evt. malaria mikroskopi samt antigen opgaver efter kl. 22.00 på hverdage, efter kl. 15.30 lørdag og efter kl. 15.00 søndag/helligdage. De Giemsa-farvede mikroskopipræparater mikroskoperes af vagthavende KMA læge, se mikroskopi for malaria instruks. Ved mikroskopi stilles Plasmodium artsdiagnosen og parasitgrad og Plasmodium malaria antigen test udføres. I sjældne
tilfælde, sendes prøven videre til konfirmering ved PCR, efter aftale med vagthavende KMA læge. |
| Databehandling og resultatfortolkning Hvis LAMP er påvist, svares den foreløbigt positiv ud (orienter lablæge/vagthavende læge, sættes på OBS-læge), malaria mikroskopi og Plasmodium malaria antigen svares også ud. Malaria LAMP og Malaria Antigen svares foreløbigt ud af bioanalytiker eller læge. Positiv mikroskopi svares endeligt ud af læge. Hvis LAMP ikke er påvist svares negativ ud og evt. fremstillet mikroskopi præparater smides ud. Hvis LAMP er inkonklusiv: Gentag proceduren fra original rør. Kan skyldes inhibition, forkert prøvehåndtering, reagensfejl, apparaturfejl, eller intern kontrol fejl. Der udføres mikroskopi ved Giemsa farvning og Malaria Antigen test. Hvis LAMP fortsat er inkonklusiv ved gentagelse, svares den ud inkonklusiv. Husk at fryse hele prøven i WWlab i FR-programmet. |
| Kvalitetskontroller Intern kvalitetskontrol Ved hver kørsel indgår intern kvalitetskontrol (højre testrør i testenheden med gul kugle reagens). Den interne kontrol kontrollerer at der er human materiale i prøven, idet dens target findes i det humane mitokondrie. Der er INGEN malaria targets i den interne kontrol. Verifikationspanel udføres mindst en gang hver 14 dag. Se produkt insert. Alethia eksterne kvalitetskontroller En Alethia positiv og en Alethia negativ kontrol udføres hver 14 dag.
Godkendelse af Alethia kontrol resultater: Positiv kontrol er positiv og negativ kontrol er negativ. Der laves ikke udstryg. Dette noteres med initialer og dato i logbog. Evt. kontamination registreres ligeledes med initialer og dato i logbog. Ekstern kvalitetskontrol ved UK NEQAS DEKS prøver som besvares. |
| Svarafgivelse Registrering af Plasmodium species
DNA (LAMP):
Svaret indtastes i wwLab. Tast <2> for at registrere analyseresultatet. Vælg Negativ/Positiv/Grænseværdi (=Inkonklusiv) fra dropdown listen:
Hvis Plasmodium species DNA ikke er påvist er analysen negativ og slutsvares med <9>.
Hvis Plasmodium species DNA er påvist eller inkonklusiv, slutsvares prøven først efter mikroskopi og antigen resultaterne er registreret.
Alle svar skal sættes på OBS-listen.
Ved Plasmodium species DNA påvist besvares mikroskopien:
Hvis der ikke findes malaria parasitter, svares: "Ved mikroskopi ses ingen malaria parasitter" (Forkodet i wwLab – Tast <0> for negativt svar).
Ved fund af malariaparasitter svares art (P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae eller P. species), (Forkodede i wwLab – Tast <1> for positivt fund og vælg art). Fase (trofozoitter, schizonter, gametocytter) og parasitaemigrad angives i SP-kommentar - findes ved at skrive "SP" i den lange linje:
Alle tre oplysninger er relevante for valg af terapi. Hvis der er færre end 1 % inficerede erythrocytter, kan der svares "Parasitaemigrad under 1 %" i SP-kommentaren. Den faktiske parasitaemigrad skrives ind som 4'er kommentar (intern laboratoriekommentar). Den kan have betydning for opfølgning ved vurdering om antal parasitter aftager. Hvis artsidentifikation på speciesniveau ikke er muligt ved mikroskopi, sendes prøven til PCR diagnostik efter aftale med bagvagt (prøve sendes til KMA, Rigshospitalet og/eller SSI). Arten Plasmodium knowlesi kræver PCR diagnostik for at stille artsdiagnostikken. Kopisvar: Ved afgivelse af positivt svar, tilføjes svarkopi til SSI, idet denne fungerer som laboratorie-anmeldelse. Tast <K> efterfulgt af Enter og skriv "SSI.ABMP" i feltet. Klik på knappen med de 3 prikker, vælg SSI ABMP og Gem. Dette udløser en papirkopi af svaret, som Sekretariatet sender til SSI.
Registrering af Plasmodium (malaria) antigen
Tast <2> for Analyseresultatregistrering. Tilføj analysen "Plasmodium antigen" ved at klikke på knappen med de 3 prikker
Og vælg Plasmodium antigen fra popup vinduet. Vælg Negativ/Positiv/Grænseværdi (=Inkonklusiv) fra dropdown listen
Tast <5> for valg af passende svarkommentar: Positivt PAN-bånd, negativt P.f.bånd (pLDH positiv): "Antigen specifikt for Plasmodium spp. er påvist." Positivt P.f.bånd, negativt PAN-bånd (HRP2 positiv): "Antigen specifikt for Plasmodium falciparum er påvist." Positivt PAN-bånd og positivt P.f.bånd (pLDH og HRP2 positiv) "Antigen specifikt for Plasmodium falciparum og Plasmodium spp. er påvist. Fundet er forenelig med infektion med P. falciparum evt. som dobbeltinfektion med non-falciparum species."
Akutte undersøgelser skal altid svares telefonisk til rekvirerende læge. |
| Vedligeholdelse og rengøringsprocedure ved kontaminering Vedligeholdelse udføres en gang om ugen. Se rengøringsprocedure ved ugentligt vedligeholdelse. Ved mistanke om kontaminering med DNA (fx amplikon eller patient prøvemateriale). Se rengøringsprocedure ved kontaminering. |
| Sikkerhed og risikovurdering |
| Affaldshåndtering Ikke risikoaffald smides i restaffald. |
| Nødprocedurer Ved instrumentnedbrud udføres mikroskopi af Giemsa farvet dråbe og udstryg præparater og Plasmodium malaria antigen udføres. Kontakt nærmeste leder. |
| Undersøgelsesprincip
Alethia Malaria molekylær assay er baseret på loop-medieret isotermisk DNA-amplifikationsteknologi til påvisning af Plasmodium sp. DNA. Analysen er rettet mod en region af Plasmodium-genomet, der er konserveret på tværs af Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae og Plasmodium knowlesi. Alethia malaria-analysens target er en 214 bp-sekvens af et ikke-kodende område af Plasmodium sp. mitokondrielt DNA.
LAMP bruger specifikt designede primere til specifik og kontinuerlig isotermisk DNA-amplifikation. Et biprodukt af amplifikation er magnesiumpyrofosfat, som danner et hvidt bundfald, der fører til en uklar reaktionsopløsning. Reaktionsopløsningens absorbansegenskaber (turbiditet) afmåles af Meridian Alethia inkubator/læseren. Ændringer i reaktionsopløsningen ved udfældning af magnesiumpyrofosfat indikerer tilstedeværelsen af target-DNA. Fraværet af target-DNA resulterer ikke i nogen signifikant ændring i prøveabsorbansen.
Alethia malariakit indeholder prøveforberedelsesapparat IV (SMP PREP IV), Alethia buffer 1 og rør. Helblodsprøver bliver først behandlet med buffer 1, hvormed celler destrueres, og nukleinsyrer frigives. Lysatet tilsættes til SMP PREP IV og filtreres i et rent rør 1, ved forsigtigt at klemme røret. Effluat opsamlet efter filtrering indeholder nukleinsyrer som anvendes på Alethia Malaria apparatet.
Alethia malaria-enheden indeholder en frysetørret amplifikationsreagenskugle i hvert af to kamre, et testkammer med Plasmodium sp. specifikke primere og et kontrolkammer med humane mitokondrielle DNA-specifikke primere.
Humant mitokondrielt DNA i helblod og de humane mitokondrielle DNA-specifikke primere i testenhedens kontrolkamre fungerer som intern kontrol for assayet.
Under prøveforberedelse bliver human mitokondrie-DNA ekstraheret med Plasmodium sp. mitokondrielt DNA for at tillade parallel behandling (processering) af target-DNA og kontrol-DNA gennem amplifikation og detektion. Den interne kontrol overvåger DNA-ekstraktion, amplifikationshæmning, assayreagensydelse og prøvebehandlingseffektivitet. Kontrolmålet skal forstærkes og detekteres i den endelige reaktion, ellers betragtes testen som ugyldig og resultaterne rapporteres ikke. |
| Medicinsk baggrund for analysen Febril sygdom efter ophold i troperne eller subtropiske områder. Malaria kan være en akut livstruende sygdom. Inkubationstiden er kortest 6 dage, oftest inden for 3 måneder for Plasmodium falciparum og for Plasmodium vivax eller Plasmodium ovale indenfor måneder til flere år efter ophold i malariaområde, men sjældent mere end 3 år efter hjemkomst. Symptomerne er uspecifikke. Typisk feber, hovedpine, kulderystelser og muskelsmerter. Komplikationer kan forekomme som påvirket bevidsthed, kramper, akut respiratorisk distress syndrom (ARDS), cirkulatorisk kollaps, abnorm blødningstendens (DIC), ikterus, hæmoglobinuri, lungeødem, almen svækkelse, hyperparasitæmi >2%, acidose, hypoglykæmi, påvirket nyrefunktion, hyperlaktæmi eller svær anæmi. Malaria DiagnostikLAMP undersøgelsen udføres på en blodprøve. Sensitiviteten og specificiteten af LAMP analyse på blod er høj. Malaria LAMP har vist en sensitivitet på 99% og specificitet på 99,2% i non-endemiske områder. Ved et negativt LAMP resultat betragtes resultatet som negativt, og der foretages ikke opfølgende undersøgelser. Ved påvist LAMP stilles Plasmodium artsdiagnose og parasitaemigrad ved mikroskopi og malaria antigen. Sjældent sendes prøven videre til konfirmering ved PCR. Behandlingen afhænger af artsdiagnose og ved Plasmodium falciparum om det er ukompliceret eller kompliceret malaria. |
Referencer
|
| | Administration - Pol..13996 Sikkerhedspolitik Prøvemodtagelse - Ins..13808 Malaria antigen test Prøvemodtagelse - Bilag.14886 Hjælpesedler til akuttavle Prøvemodtagelse - Ins..14810 Malaria Plasmodium DNA/RNA LAMP Bilag: 1, Malaria LAMP procedure (pdf) Bilag: 3, LAMP malaria program quick guide (pdf) Bakteriologi - Ins..14114 Giemsa farvning Analyse info - Data.14063 Plasmodium (malaria) Mikroskopi Bilag: 2, Malariaprogram (pdf) Læger - Ins..14142 Mikroskopi Malaria Kvalitet - Ins..14655 Instruks til eksterne kvalitetskontrolprøver i bakteriologien (DEKS) Bilag: 5, Rengøringsprocedure ved kontaminering (docx) Bilag: 4, Rengøringsprocedure ved ugentligt vedligehold (docx) |
| | Bilag: 1, Malaria LAMP procedure 2, Malariaprogram 3, LAMP malaria program quick guide 4, Rengøringsprocedure ved ugentligt vedligehold 5, Rengøringsprocedure ved kontaminering |
| Administration - Pol..13996 Sikkerhedspolitik |
| Prøvemodtagelse - Ins..13808 Malaria antigen test |
| Prøvemodtagelse - Bilag.14886 Hjælpesedler til akuttavle |
| Prøvemodtagelse - Ins..14810 Malaria Plasmodium DNA/RNA LAMP |
| Bilag: 1, Malaria LAMP procedure (pdf) |
| Bilag: 3, LAMP malaria program quick guide (pdf) |
| Bakteriologi - Ins..14114 Giemsa farvning |
| Analyse info - Data.14063 Plasmodium (malaria) Mikroskopi |
| Bilag: 2, Malariaprogram (pdf) |
| Læger - Ins..14142 Mikroskopi Malaria |
| Kvalitet - Ins..14655 Instruks til eksterne kvalitetskontrolprøver i bakteriologien (DEKS) |
| Bilag: 5, Rengøringsprocedure ved kontaminering (docx) |
| Bilag: 4, Rengøringsprocedure ved ugentligt vedligehold (docx) |